pcr反应体系包括哪几个组分
pcr反应体系包括哪几个组分的答案是:寡核苷酸(引物);4种dNTP;TaqDNA聚合酶;靶序列DNA和PCR反应缓冲液体系
(1)引物长度- 一般15~ 30碱基,过短则特异性低; 过长则会引起引物间的退火而影响有
效扩增。
(2) 避免内部二级结构,避免序列内有较长的回文结构,使引物自身不能形成发夹结构。
(3) G/C 和A/T 碱基均匀分布,G/C 含量在45%~ 55% 之间,引物碱基序列尽可能选
择碱基随机分布,避免嘌呤、嘧啶的连续排列。
(4) 要避免两个引物间特别是3' 末端DNA 序列互补以及同一引物自身3' 末端的序列互补,使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。
(5) 引物3' 端碱基一般应与模板严格配对,并且3' 端为G、C 或T 时引发效率较高。
(6) 引物5' 端碱基可不与模板匹配,可添加与模板无关的序列(如限制性内切酶的识别
位点、ATG 起始密码子或启动子序列等)。这些与原初模板并不配对的非互补序列在后续的循
不中将被带到双链DNA 中去,这样反应产物不仅含有目的序列,同时在目的基因两侧又有了
的限制酶切位点,用相应的限制酶切割后即可将PCR 产物定向克隆到载体中。
类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性)--延伸三个基本反应步骤构成:模板DNA的变性,模板DNA经加热至94℃左右一定时
间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;模板DNA与引物的退火(复性),模板DNA经加热变性成单链后,温度降至40~60℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;引物的延伸,DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下,于72℃左右,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
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